拉曼光譜儀

引言

拉曼光譜技術(shù)作為一種快速、非破壞性的分析方法，正在成為制藥領(lǐng)域中最&受歡迎的分析測量工具之一，在原料驗證、藥物生產(chǎn)過(guò)程監控以及產(chǎn)品質(zhì)量控制中都發(fā)揮了重要作用。拉曼光譜技術(shù)基于拉曼散射原理，通過(guò)測量樣品與激光光束相互作用后發(fā)生的光子能量變化，獲取樣品的化學(xué)成分和結構信息。在實(shí)際運用中，激光首先聚焦到樣品表面，激發(fā)出的非彈性散射信號（即拉曼信號）被收集并導入到光譜儀中，光譜儀對該信號進(jìn)行波長(cháng)分離，再由探測器將光子能量轉換為電信號以供分析。拉曼光譜技術(shù)的一個(gè)顯著(zhù)優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需提取或制備樣品，并且激光可以輕松地聚焦到樣品來(lái)進(jìn)行化學(xué)測量，這通?？梢栽谝环昼娀蚋痰臅r(shí)間內完成。其快速、高靈敏度和高分辨率的優(yōu)勢使其成為了藥物研發(fā)和生產(chǎn)中的一項重要工具。本文將深入探討拉曼光譜在制藥領(lǐng)域中的具體應用，包括藥物結構表征、藥物形態(tài)分析、藥物質(zhì)量控制以及藥物相互作用研究，并結合真實(shí)案例進(jìn)行詳細分析。

1. 藥物合成研究

一旦確定了潛在的新藥，就可以開(kāi)發(fā)、優(yōu)化該分子的合成方法。拉曼光譜非常適合監測反應物、中間體和產(chǎn)物濃度，確定各種反應類(lèi)型（例如Diels-Alder反應、Fischer酯化反應、格氏反應和?；?/span>化反應等）的路徑、動(dòng)力學(xué)、機制、終點(diǎn)和產(chǎn)率。阿司匹林的合成是一個(gè)經(jīng)典的?；?/span>反應，反應的歷程一般認為有四面體結構的中間體出現，但由于其純凈物難以分離獲取，所以一直沒(méi)有直接的證據證明該中間體的存在。利用拉曼光譜技術(shù)在反應過(guò)程中進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤檢測，可以得到在反應過(guò)程中不同時(shí)刻的拉曼光譜（圖1 A），發(fā)現了阿司匹林的合成反應過(guò)程中有中間體出現，并直接觀(guān)測到此中間體在波數為1694cm^-1的位置有一明顯的拉曼特征峰。光譜經(jīng)數據處理后，還可以獲得到各組分含量的相對變化曲線(xiàn)（圖1 B）。

圖1 （A）實(shí)驗過(guò)程中的拉曼光譜隨時(shí)間的變化；（B）阿司匹林合成過(guò)程中各組分的回歸系數及1694cm^-1位置的相對峰高隨時(shí)間的變化。

通過(guò)在線(xiàn)拉曼光譜可以清楚、直接地看到反應的進(jìn)程，輕松確定反應速率、速率常數和產(chǎn)量；在優(yōu)化反應器溫度、催化劑濃度和類(lèi)型的影響的同時(shí)，還可用于確定活化能和反應終點(diǎn)以及優(yōu)化產(chǎn)率。

2. 藥物晶型研究

大多數情況下，原研藥企業(yè)會(huì )使用API最&穩定的晶型以避免在生產(chǎn)儲存過(guò)程中發(fā)生晶型轉變。為保險起見(jiàn)，仿制藥企業(yè)通常會(huì )選擇與參比制劑（RLD）或原研制劑相同的API晶型，以保證相似的穩定性和溶出特性。因此，確定原研制劑中API晶型是仿制藥研發(fā)的關(guān)鍵步驟，這也是逆向工程中最重要的任務(wù)。晶型檢測有著(zhù)一系列可選擇的分析方法，如X射線(xiàn)粉末衍射、差示掃描量熱、熱重分析、紅外光譜及拉曼光譜等。然而，對于制劑中無(wú)定形或低含量API的晶型檢測，可用的方法就相對較為局限。

2.1制劑中無(wú)定形API的檢測

X射線(xiàn)粉末衍射被認為是多晶型化學(xué)物質(zhì)指紋性和專(zhuān)屬性的首&選表征手段。一般制劑中的API晶型檢測相對直接，但當API為無(wú)定形時(shí)，X射線(xiàn)粉末衍射檢測失去作用，如下所述案例。已知某制劑中API有2種固態(tài)形式:無(wú)定形和半水合物。為確定2個(gè)不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的片劑（藥片A、B）中API晶型是否一致，首先需要應用X射線(xiàn)粉末衍射對藥片A、B中API晶型進(jìn)行鑒定。對比藥片A、B與API的X射線(xiàn)粉末衍射圖可見(jiàn)，藥片A的X射線(xiàn)粉末衍射圖譜與API半水合物特征峰在整個(gè)圖譜上都有很高的吻合度（見(jiàn)圖2a和2d）。因為該API只能以無(wú)定形和半水合物形式存在，因此可以基本肯定藥片A所含API為半水合物。當比較藥片B的X射線(xiàn)粉末衍射圖譜（見(jiàn)圖2b）與API半水合物時(shí)，很難判斷藥片B中的API是否也為半水合物。由于藥片中同時(shí)含有晶體輔料（如乳糖）和其他無(wú)定形輔料，藥片B中API的晶型無(wú)法通過(guò)X射線(xiàn)粉末衍射來(lái)確定。

圖2 藥片A、藥片B、無(wú)定形API和API半水合物的X射線(xiàn)粉末衍射圖

應用拉曼光譜技術(shù)，比對圖3中藥片A、B與API的拉曼光譜圖。藥片A的拉曼圖譜與API半水合物的圖譜基本一致（見(jiàn)圖3a和3d）。同時(shí)，藥片B的拉曼圖譜與無(wú)定形API的圖譜基本一致（見(jiàn)圖3b和3c）。因此，在這種情況下，拉曼光譜可以很好地解決無(wú)定形API在制劑中的鑒定問(wèn)題。通常，不同固態(tài)形式API的拉曼光譜間有一定差異。與結晶形API相比，無(wú)定形API的拉曼光譜表現為更寬的峰形，且有波數偏移。通過(guò)將實(shí)測樣品的拉曼光譜與不同晶型API的參考拉曼光譜進(jìn)行比對，可鑒定制劑中API的晶型。

圖3 藥片A、藥片B、無(wú)定形API和API半水合物的拉曼光譜圖

值得一提的是，通常輔料拉曼信號很弱，低于A(yíng)PI信號，故拉曼技術(shù)用于不同廠(chǎng)家不同輔料的相同制劑時(shí)，可以在某些情況下完&全排除輔料對API的干擾。該特性極利于制劑中低含量API的晶型檢測，即使API的含量較低，其在制劑中的信號仍然有可能被檢測到，這對于制劑中API的晶型鑒定尤為重要。

2.2制劑中低含量API的檢測

某原研片中API含量較低，僅為0.5%。文獻報道API有A、B、E這3種晶型，且晶型E很難制備。比較原研片與文獻中3種晶型的X射線(xiàn)粉末衍射圖，未找到與3種晶型相對應的衍射峰，再將原研片與片劑中主要輔料一水乳糖的X射線(xiàn)粉末衍射圖比較，發(fā)現其X射線(xiàn)粉末衍射圖與一水乳糖幾乎一致（見(jiàn)圖4），表明輔料一水乳糖嚴重干擾了制劑中API的衍射信號。

圖4 原研片與一水乳糖以及文獻中API晶型A、B、E的X射線(xiàn)衍射圖

應用拉曼技術(shù)采集原研制劑的單點(diǎn)拉曼光譜，因單次采集樣品信號面積小，可相對有效避開(kāi)大量輔料的影響，采集到較強的API信號。將已采集到的原研制劑中的拉曼圖譜與不同晶型的拉曼圖譜相比較，即可鑒定制劑中的API晶型。如圖5所示，該原研片采集到的單點(diǎn)拉曼光譜為較純的API光譜，不受一水乳糖的干擾，且晶型A、B有不同的拉曼特征峰，比對原研片與晶型A、B的拉曼光譜（見(jiàn)圖6），可明顯看出，原研片中的API為晶型A。

圖5 原研片和一水乳糖的拉曼光譜

圖6 原研片與文獻中API晶型A和B的拉曼光譜

3. 藥物質(zhì)量研究

凍干制劑中藥物分布均勻性在一定程度上可反映制劑微觀(guān)結構的一致性，與凍干工藝密切相關(guān)。預凍方式、預凍時(shí)間、凍干曲線(xiàn)都可能影響到藥物和輔料的析出速度與程度，從而影響凍干物結構和藥物分布均勻性。良好的凍干結構能夠保證凍干過(guò)程中溶劑順利逸出，反之會(huì )增加溶劑揮發(fā)阻力。結構上的不均勻可能會(huì )導致局部溶劑殘留增加，甚至可能會(huì )使活性藥物成分局部降解，影響產(chǎn)品穩定性和體內藥效以及毒性。因此藥物分布均勻性是凍干制劑的一個(gè)重要質(zhì)量屬性，可在多方面影響產(chǎn)品質(zhì)量和體內性質(zhì)，有必要對其進(jìn)行評價(jià)。

近年來(lái)，基于不同光譜的顯微成像技術(shù)在藥物質(zhì)量表征和研究中得到越來(lái)越多的應用，通過(guò)化學(xué)顯微成像可以在保持樣品完整的前提下直觀(guān)獲得樣品內部的結構信息。其中，采用拉曼光譜成像法評價(jià)藥物活性成分在制劑中的分布均勻性受到了較多關(guān)注，主要因為其可以在一定程度上反映產(chǎn)品制劑工藝特征，有助于產(chǎn)品質(zhì)量評價(jià)、工藝分析優(yōu)化以及偽藥劣藥鑒別。該評價(jià)方法在片劑中的應用已相對成熟，采用夾峰法進(jìn)行成像處理，便可得到各成分在制劑中的分布成像圖。在評價(jià)注射用凍干制劑中藥物分布均勻性時(shí)，夾峰法進(jìn)行成像處理，結果發(fā)現即使將圖譜采集精度減小到步長(cháng)1μm，也無(wú)法將制劑中的藥物和輔料區分，這是因注射用凍干制劑生產(chǎn)工藝與片劑不同導致的。片劑生產(chǎn)工藝中藥物和輔料為物理混合，且粉末粒度通常在微米級別，將圖譜采集步長(cháng)減小到藥物輔料粉末粒度以下，采集到的拉曼光譜為單一成分的光譜圖，因此采用夾峰法成像可將藥物和輔料輕易區分，觀(guān)察到制劑中藥物成分分布的圖像。而凍干制劑通常將藥物和輔料先全部溶解于同一介質(zhì)中，經(jīng)過(guò)冷凍干燥過(guò)程將液體介質(zhì)去除形成固體凍干物。此時(shí)藥物在輔料中呈高度分散的狀態(tài)，大部分掃描點(diǎn)下的光譜圖中都同時(shí)含有藥物和輔料的特征峰，采用夾峰法成像無(wú)法將二者區分?；趦葮朔ɡ庾V定量分析的原理，可采用藥物-輔料峰強度比值法以二者特征峰的相對強度值對凍干制劑拉曼圖譜進(jìn)行成像處理。方法學(xué)驗證結果表明，該方法可以準確反映凍干制劑中藥物與輔料的相對含量，以此對凍干制劑中藥物分布均勻性進(jìn)行分析與評價(jià)。同時(shí)研究中也發(fā)現，由于凍干制劑為疏松多孔的塊狀物，進(jìn)行拉曼光譜采集時(shí)掃描平面不如片劑平整，導致不同掃描點(diǎn)下的拉曼光譜圖信號強弱不一，而采用峰強度比值法進(jìn)行成像，以藥物輔料相對含量進(jìn)行評價(jià)，也可以很好地解決這一缺陷給均勻性分析帶來(lái)的影響。因此峰強度比值法比經(jīng)典的夾峰法更適合用于對凍干制劑中藥物分布均勻性的評價(jià)。

圖7 五種產(chǎn)品中培美曲塞二鈉（峰值1625cm^-1）和甘露醇（峰值480 cm^-1）在5個(gè)不同區域的拉曼強度相對比值成像圖。標尺100μm。

4. 藥物制劑的鑒定

拉曼光譜法是重要的分子光譜技術(shù)，同紅外光譜一樣，可用于化合物結構分析，可以對原料藥、輔料、藥物晶型、藥物制劑實(shí)現鑒別，其準確度較高。由于水的拉曼散射效應很弱，用拉曼光譜對水溶性注射劑測定時(shí)，水不干擾光譜。因此，拉曼光譜在對注射液品種的鑒別上具有紅外光譜無(wú)法比及的無(wú)前處理、簡(jiǎn)單、準確等優(yōu)勢。

目前已建立了拉曼光譜無(wú)損檢測液體制劑的快速篩查方法，其原理是通過(guò)從注射液的拉曼光譜中將來(lái)源于水及其他輔料部分有效排除，對活性藥物成分的拉曼光譜與標準參考光譜進(jìn)行對比判斷藥物的真偽來(lái)實(shí)現鑒別。

《中國藥典》2010年版附錄已經(jīng)收載拉曼光譜法指導原則，2015年版藥典通則收錄拉曼光譜法為藥典方法，但還沒(méi)有在品種項下得到體現。在對2010年版藥典收錄的注射液各論中〔鑒別〕項的調研中，發(fā)現有氨茶堿注射液、氨甲環(huán)酸注射液等8個(gè)品種采用了紅外光譜法鑒別。由此可見(jiàn)，采用紅外光譜鑒別注射液，主要通過(guò)提取、純化、干燥，在得到純的藥物固體晶體或粉末的基礎上實(shí)現的。前處理的主要目的是消除水及輔料對紅外光譜圖的影響。拉曼光譜不用提純干燥，可以直接測試進(jìn)行鑒別。因此可以針對上述8個(gè)液體品種，探討使用拉曼光譜替代現有的紅外光譜鑒別，或者作為紅外光譜鑒別備選項的科學(xué)性和有效性。

圖8 氨茶堿注射液與氨茶堿對照品溶液的拉曼光譜圖

圖9 氨甲環(huán)酸注射液與氨甲環(huán)酸對照品溶液的拉曼光譜圖

由圖8、圖9可知，采用拉曼光譜法進(jìn)行鑒別，具有前處理簡(jiǎn)單，鑒別準確度與紅外光譜法相當等優(yōu)勢，因此具有使用拉曼光譜替代現有的紅外鑒別項，或者作為紅外鑒別項的備選項的可能性。通過(guò)對152個(gè)注射液品種質(zhì)量標準的調研，發(fā)現有23個(gè)注射液品種〔鑒別〕項下只有一般化學(xué)反應，沒(méi)有采用儀器的方法；有143個(gè)品種的〔鑒別〕項下不包含分子光譜的方法。對于這些品種，拉曼光譜可以作為一個(gè)候選的鑒別方法，作為這些注射液品種鑒別的補充，結果將是科學(xué)的和有效的。

結論

綜上所述，拉曼光譜技術(shù)作為一種先進(jìn)的光譜分析方法，在制藥工程中發(fā)揮著(zhù)重要作用。隨著(zhù)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，相信拉曼光譜技術(shù)將在制藥工程中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，為藥物研發(fā)和生產(chǎn)提供更加可靠、高效的分析手段，助力制藥行業(yè)不斷取得新的突破和進(jìn)步。

奧譜天成是國產(chǎn)拉曼光譜儀領(lǐng)&軍&品牌，具有手持式、便攜式、科研級、工業(yè)在線(xiàn)級全系列拉曼產(chǎn)品線(xiàn)，能夠為藥物研究單位及工業(yè)企業(yè)客戶(hù)提供全場(chǎng)景的應用解決方案。

奧譜天成生產(chǎn)的拉曼光譜儀產(chǎn)品系列（截止2020年12月）

參考文獻：

李衛華,呂國偉,黃蘭等.阿司匹林合成過(guò)程的在線(xiàn)拉曼光譜研究[J].物理化學(xué)學(xué)報,2003,(02):105-108.

田芳,ZIMMERMANN Anne,MCGOVERIN Cushla等.拉曼技術(shù)在藥物逆向工程中的應用[J].藥學(xué)進(jìn)展,2016,40(12):897-905.

韓靜,姚靜,董美陽(yáng),等.共焦顯微拉曼光譜成像技術(shù)探究?jì)龈芍苿?注射用培美曲塞二鈉中藥物分布均勻性[J].藥學(xué)學(xué)報, 2022(007):057.

趙瑜,尹利輝,曹麗梅,肖新月.拉曼光譜法用于藥品注射液標準中鑒別項的探討[J].中國藥品標準,2015,16(06):416-420.